HPLC的梯度洗脫

發布日期：2014-07-08 點擊：2491

HPLC的梯度洗脫類似于GC的程序升溫。程序升溫是GC在分析過程中不斷改變溫度，而HPLC的梯度洗脫是在分析過程中不斷改變流動相的組成。錄用等度（一種流動相）洗脫分離一組組分時，每一個峰的值小于最后一個峰的1/30時，可考慮用梯度洗脫方法。
一組氯代苯同系物，若用等度洗脫，最后一組分的色譜峰值＞第一個組分的色譜峰值30倍，選用梯度洗脫，所有組分譜峰的峰寬基本相等，縮小了值的差異，縮短了分析時間。
梯度洗脫用兩種以上的流動相，而且是在儀器運轉過程中在線混合，必須由特殊的泵件和混合裝置進行有效的混合。
1、低壓混合
這種裝置是由幾種不同的流動相由控制器按不同的比例打入低壓混合中混合后再由泵打入柱內。要求控制器準確、及時將不同的流動相打入低壓混合器中進行有效的混合。
2、高壓混合
高壓混合從兩個以上的高壓泵中按比例流出的流動相的混合器中混合。流動相組成比例取決于每個泵的相對流速。高壓混合裝置可使流動相不需脫氣泡的影響小。
3、高低壓混合
這種裝置利用低壓比例閥加高壓混合，僅需一個泵，流動相不需脫氣。流動相1由高壓泵打進，流動相2由壓差重力作用流入混合室中。控制閥A、B、C主要是排空、放氣，并能適當調節兩流動的比例。比例閥D、E控制兩流動相最后進入混合室的比例。
以二元梯度的反相色譜為例，一般先用大比例的弱溶劑（水），而后不斷增大強溶劑（甲醇、乙腈）的比例，減小弱溶劑的比例。弱保留分先離開色譜術，然后由弱保留組分到強保留組分被逐步洗脫下來。因流動相的強度不斷變化，相當于無數個等度洗脫組成了梯度洗脫。所以梯度洗脫的色譜峰的半寬和相對的值基本相等。
分離檢測人血中16種氨基酸用反相色譜梯度洗脫，C18，氨基酸被衍生化后柴紫外檢測器檢測。流動相A為四氫呋喃-甲醇-0.1mol/L乙酸鈉（pH7.2）=5：95：900；流動相B 為甲醇。
流速為0.40mL/min,柱溫為40℃。本方法有效地分離了16種氨基酸，最小檢知量為15.0umol/L，線性范圍17.0～1000.0umol/L，各氨基酸的相關系數R≈0.998，回收率為89%～95%，RSD＜7.0%。
用反相HPLC等度洗脫方法對喹諾酮抗生素帕珠沙星合成產物做質量控制。弱溶劑配制的流動相，帕珠沙星為45min色譜峰擠在一起，無法定量。改用數種HPLC等度洗脫方法，結果都不理想。用梯度洗脫方很容易解決了問題。
在梯度洗脫時開始的流動相中強溶劑的比例不能太大，否則前面的色譜峰擠在一起。
兩個梯度之間必須有一個過渡平衡時間，如分析氨基酸時，從31min到32min為平衡時間。平衡時間不足，相連的兩個樣品色譜峰的保留時間就不一樣，這是因為前一個梯度的流動相滯留影響了后一個流動相的組成。

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